寡核苷酸藥物（Oligonucleotide）是一類由幾十個(gè)核苷酸組成的，序列較短的核酸分子。其主要是通過基因沉默抑制靶蛋白的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的。

與傳統(tǒng)藥物相比，寡核苷酸藥物具有多重技術(shù)優(yōu)勢，包括：（1）特異性高；（2）高效性；（3）長效性，降低給藥頻率；（4）研發(fā)周期短，臨床轉(zhuǎn)化與研發(fā)成功率相對較高；（5）靶點(diǎn)豐富，適應(yīng)癥廣等。目前人工合成的寡核苷酸藥物分類如圖1所示。其中反義寡核苷酸（ASOs）、小干擾 RNA（siRNA）為臨床中開發(fā)的寡核苷酸藥物的主要形式。

圖1

反義核酸藥物于1998年獲批上市，開啟了寡核苷酸藥物上市的征程；siRNA藥物Patisiran于2018年獲批上市，更具有里程碑意義，近兩年來已有四款siRNA藥物陸續(xù)獲批上市。截止2021年，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球已有16款寡核苷酸藥物獲批上市（如圖2），有超過400個(gè)化合物處于研發(fā)階段。除Spinraza作為孤兒藥在中國獲批上市外，暫時(shí)無其他產(chǎn)品在國內(nèi)上市。

圖2

這里有一些修飾寡核苷酸的例子：

RNA是非常不穩(wěn)定的，半衰期特別短。因此我們需要一些結(jié)構(gòu)修飾，主要是為了抵消核酸酶的作用及更有利的藥代動力學(xué)分析。譬如硫代磷酸化：用硫基團(tuán)取代磷酸二酯骨架的非橋連氧，最大限度地減少了內(nèi)切和外切核酸酶的水解，這樣就使DNA或者RNA的壽命大大增長。但是從液相色譜的角度來講，這些硫代磷酸化的DNA或者RNA會給我們分析帶來一些挑戰(zhàn)，因?yàn)樵谶M(jìn)行硫代以后，中間的磷原子變成了一個(gè)手性中心，這可以產(chǎn)生 2n 個(gè)異構(gòu)體，其中 n 是硫代鍵的數(shù)量?，F(xiàn)在關(guān)于引入手性對于這類分子的生物性能到底有沒有影響還存在爭議。但對于色譜分析來說，更多的手性異構(gòu)體在反相色譜的分析中，會導(dǎo)致峰寬變寬。（圖3）

其他值得注意的修飾是寡核苷酸的糖基團(tuán)部分，通常是基于 RNA 的寡核苷酸 2 ’號位羥基的修飾。此處去除氫也使與磷酸二酯相關(guān)的水解最小化。

另外，對核糖本身的修飾如橋聯(lián)核酸BNA（bridged）或鎖核酸LNA（Locked）。這使得其具有更高的親和力，更好的單堿基錯配識別能力，并且對核酸酶的耐受性更高。

圖3

關(guān)于寡核苷酸藥物固相合成后的分析，目前我們重點(diǎn)來講一下反相色譜分析：

除了離子交換填料，比如高效SAX填料，非多孔而是實(shí)心球加表面固定相的模式。純化和分析中的一大類是反相色譜。這里主要使用的是混合硅膠C18固定相，因此其分離度和柱效都要高不少。飛諾美Clarity Oligo-RP固定相采用聚合物和硅膠鍵合填料顆粒，由于其在高pH下的穩(wěn)定性表現(xiàn)，在寡核苷酸的純化方面被廣為使用。

針對醫(yī)藥工作者對寡核苷酸分析日益增長的需求，飛諾美推出全新bioZen® Oligo系列寡核苷酸分析產(chǎn)品。全新升級的BioTi生物兼容性硬件，提高色譜柱的分析靈敏度和穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)不銹鋼硬件相比，BioTi在低進(jìn)樣量的分析條件下能有效改善回收率，尤其對生物樣品中的寡核苷酸表征和定量分析中有著優(yōu)異的效用。

此外，bioZen® Oligo系列的核-殼顆粒，具有高度均一的顆粒形態(tài)，從而保證了高柱效并縮小峰寬。尤其在寡核苷酸反相分析所需的高pH和高溫條件下，仍有穩(wěn)定優(yōu)異的分離表現(xiàn)。

通過bioZen® Oligo系列產(chǎn)品與Clarity™ Oligo™系列的配合，飛諾美為寡核苷酸的前處理和分析提供了全套的解決方案。

寡核苷酸屬于酸性強(qiáng)極性化合物，在一般色譜柱上很難保留。所以我們需要加入離子對試劑來進(jìn)行其中離子對反相色譜分析，如圖4所示離子對試劑增強(qiáng)寡核苷酸在反相色譜上的保留原理主要基于兩點(diǎn)：首先，帶正電的離子對試劑會與帶負(fù)電的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中構(gòu)成離子對，減少了寡核苷酸的凈電荷并增加了其疏水性，此時(shí)疏水相互作用促成了寡核苷酸在離子對反相色譜中的保留；再者，離子對試劑依靠其疏水性烷基鏈可以吸附于反相色譜的固定相上以形成離子交換劑（Ion exchanger），此時(shí)靜電相互作用將幫助寡核苷酸在反相色譜中的保留。

圖4

離子對試劑的種類繁多，常用離子對主要為基于乙酸胺試劑和基于六氟異丙醇（HFIP）的胺類離子對試劑。但基于 HFIP的離子對試劑較基于乙酸的離子更為常用，因?yàn)榕c乙酸相比，HFIP的沸點(diǎn)和酸性更弱，這意味著 HFIP 在電噴霧離子化的氣相狀態(tài)下更容易揮發(fā)，對寡核苷酸的離子化干擾更小，與電噴霧質(zhì)譜更兼容。常見的離子對試劑主要有三乙胺（TEA）、醋酸三乙胺（TEAA）、碳酸三乙胺（TEAB）、六氟異丙醇（HFIP）。圖5整理一些關(guān)于用于反義寡核苷酸的色譜方法參數(shù)。

圖5 通過TEA和HFIP平衡離子對和離子抑制

（建議優(yōu)化的濃度配比）

典型圖譜示例如下：

第二部分：寡核苷酸的生物分析樣品處理解決方案：

為了解決寡聚核苷酸樣品制備所面臨的挑戰(zhàn)，飛諾美先后推出了Clarity OTX 96孔板和寡聚核苷酸樣品前處理裂解液，使得整個(gè)SPE前處理時(shí)間可降低至15分鐘，大大縮短實(shí)驗(yàn)室花費(fèi)在樣品前處理上的時(shí)間成本。

高靈敏度寡核苷酸樣品的凈化和萃取/

? 典型萃取回收率 > 80％（有些Oligo藥物優(yōu)化后可達(dá)90%以上）

? 無需液液萃?。↙LE）

? 適用于大多數(shù)治療性寡核苷酸、組織和體液樣品

? 針對 LC-MS 生物分析進(jìn)行了優(yōu)化

? 可以實(shí)現(xiàn)自動化以提高通量

Clarity OTX -SPE操作概述

請注意：裂解液的使用體積，平衡時(shí)的pH值，洗脫時(shí)調(diào)整到pH為9.5等這幾個(gè)參數(shù)非常重要。

Q & A

常見的OTX-SPE操作問答

1.使用Clarity OTX產(chǎn)品可以從生物液體中提取什么類型的藥用寡核苷酸？

DNA、RNA、miRNA、siRNA、硫代磷酸、LNA、單鏈、雙鏈和寡核苷酸藥制劑。只要存在磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架，提取方法都具有良好的純化效果和回收率。要注意當(dāng)遇到硫代磷酸酯骨架的siRNA，在最后一步洗脫液中可以加入少量的TCEP，提高提取回收率。

2.一般可以檢測到的濃度范圍是多少？

對于某些寡核苷酸來說，可以實(shí)現(xiàn)到 1-2000 ng/mL 的線性校準(zhǔn)曲線。由于每種寡核苷酸各不相同，并且每種液體/組織的基質(zhì)都很特別，因此會有不同的定量曲線范圍。

3. 所含緩沖液是否具有核酸酶抑制作用？

是的，具有核酸酶抑制作用。目前配制的裂解上樣緩沖液可進(jìn)行細(xì)胞裂解并去除生物液體中的所有蛋白酶活性。

4. SPE板的填料mg規(guī)格如何選擇，核酸藥是否在組織中分布的更多？

一般血漿樣品處理可以選擇25mg規(guī)格（8E-S103-CGA）；組織樣品可以選擇100mg（8E-S103-EGA），因?yàn)楹怂崴幵诮M織中分布量更大，肝/血濃度能高達(dá)幾百倍以上差距。

5. 是否需要正壓或真空負(fù)壓？

在大多數(shù)情況下是需要正壓或負(fù)壓裝置。Clarity OTX填料的粒度不適用于重力萃取。需要負(fù)壓裝置能夠達(dá)到至少10英寸汞柱的壓力, 在生物分析行業(yè)一般選擇正壓SPE裝置比較多，推薦艾杰爾正壓萃取裝置(P/N: SPE-M96) 。

6. Clarity OTX提取柱管和96孔板能否重復(fù)使用？

不能重復(fù)使用。與目前的提取程序不同，Clarity OTX產(chǎn)品需要使用裂解液buffer才能從生物液體中分離和提取寡核苷酸。提取目標(biāo)低聚序列時(shí)，基質(zhì)污染物保留在介質(zhì)上。因此，即使經(jīng)過反復(fù)嚴(yán)格地清洗，也無法有效去除這些污染物。所以重復(fù)使用會污染后續(xù)樣品。

7. 在核酸藥的提取過程中有哪些注意事項(xiàng)，需要低吸附板，槍頭嗎？如何提高提取回收率？

是的，請全程帶手套操作，盡量配置低吸附孔板，槍頭等；提取回收率的提高請注意三點(diǎn)：一定要保證裂解液在有效期內(nèi)，第一步將核酸藥與血漿或組織樣中的蛋白解離，然后將SPE板活化好之后，在酸性條件下將樣品load到SPE板上，pH值為5~7之間（依據(jù)核酸樣品種類不同可以微調(diào)）；在wash的步驟上可以優(yōu)化，最后一步Elute的步驟要調(diào)節(jié)pH為9.5左右非常重要；然后將樣品進(jìn)行氮?dú)獗Ｗo(hù)下的吹干，一般設(shè)置溫度為45攝氏度左右。

常見訂購信息如下：