馬淑偉  李倩  楊定忠  朱旭東  孫永超

  （天津博納艾杰爾科技有限公司）

摘要：氨基酸分析是飼料中含氮量測定和蛋白質含量測定的一種重要輔助手段，隨著反相色譜技術的發展，采用反相HPLC色譜測定氨基酸越來越普遍。本文使用Venusil-AA氨基酸分析方法包建立了飼料中氨基酸分析的HPLC方法，在50-1250nmol/mL的濃度范圍內，18種氨基酸具有良好的線性范圍，相關系數r大于0.999，檢測限約為5pmol，具有良好的重復性和穩定性，并且通過使用不同的HPLC儀器驗證了該方法具有良好的耐用性。

液相色譜儀（配制要求：可梯度洗脫，紫外檢測，可控柱溫）； Venusil-AA氨基酸分析方法包（天津博納艾杰爾科技，包括：Venusil AA氨基酸分析柱1支，4.6×250mm，5μm；PITC異硫氰酸苯酯衍生劑10瓶，25μL/瓶；含17種氨基酸的標準溶液2瓶，2mL/瓶；內標物正亮氨酸1瓶，100mg/瓶；衍生溶媒三乙胺2瓶，1.4mL/瓶）；塑料離心管，1.5mL；實驗室用樣品粉碎機；樣品篩: 孔徑0.25mm；離心機；真空泵 ；恒溫干燥箱；水解管：安瓿瓶體積20～30mL（用去離子水沖洗干凈并烘干）；氮吹儀，噴燈等

鹽酸（優級純）；無水醋酸鈉（分析純）；冰醋酸（分析純）；乙腈（色譜純）；去離子水；苯酚（蒸餾）；高純氮氣（純度99.99%）；冷凍劑（市售食鹽與冰按1：3混合）

色譜柱：Venusil-AA氨基酸分析柱（100Å，4.6mm×250mm ，5μm）

檢測波長：254 nm；柱溫：40℃

    流動相A：稱取15.2g無水醋酸鈉，加水1850mL，溶解后用冰醋酸調pH至6.5，然后     

  加乙腈140mL，混勻，用0.45µm濾膜過濾。

    流動相B：80%（V/V）乙腈溶液，進樣量：2µL

    流速：1mL/min，梯度洗脫（不同色譜儀器，梯度洗脫條件略有不同，見表1）

1.4.1  0.1mol/L鹽酸溶液：量取9.0mL濃鹽酸，加去離子水稀釋至1000mL。

1.4.2  正亮氨酸內標溶液：稱取正亮氨酸約10mg，加0.1mol/L 鹽酸溶液 10mL溶解，混勻。

1.4.3  三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1瓶，加乙腈8.6mL，混勻。

1.4.4  異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2mL，混勻。

1.4.5  6mol/L鹽酸（含0.1%苯酚）：稱取苯酚20mg，加濃鹽酸10mL和水10mL溶解，混勻。

1.4.6  混合氨基酸標準溶液（標液氨基酸濃度見表2）：準確量取氨基酸標準溶液1.0mL，置于5mL容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液定容至刻度。（該溶液在4°C可保存2個月，在-20°C下可保存6個月）。

1.4.7　異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2mL，混勻。

由于在酸水解過程中，色氨酸（Trp）幾乎被破壞，因此如需測定色氨酸，則應采用堿水解法來水解樣品。Venusil-AA氨基酸分析方法包的氨基酸標準溶液中不含有色氨酸，如要測定色氨酸，需單獨購買，用前配制。

1.5.1飼料游離氨基酸含量測定樣品溶液制備

準確稱取適量飼料（使樣品中需測定的單個氨基酸含量在5～10mg或總氨基酸含量在100-150mg范圍內），置于燒杯中，加0.1 mol/L鹽酸30mL，攪拌提取15 min，靜置5分鐘，將上清液過濾到100 mL容量瓶中，殘渣加0.1 mol/L鹽酸25mL,攪拌3 min，重復提取兩次，再將上清液過濾到上述容量瓶中，用水沖洗濾紙上的殘渣，收集濾液并加0.1mol/L鹽酸定容至刻度，搖勻。

1.5.2 飼料水解氨基酸含量測定樣品溶液制備

1.5.2.1 酸水解法：

準確稱取一定量樣品，使樣品氨基酸總量在50～75mg范圍內, 置于20-30mL安瓿瓶中，加入10mL含0.1%苯酚的6mol/L鹽酸, 振搖使樣品溶解或使樣品均勻分散于溶液中，將安瓿瓶置-20℃冰箱中冷凍3～5min，充氮后用噴燈熔封，然后置110±1℃烘箱中水解24小時, 取出冷卻，打開安瓿瓶，將水解液全部轉移到50mL容量瓶內，用超純水或去離子水定容至刻度，混勻, 供衍生使用。

1.5.2.2 堿水解法：

準確稱取一定量樣品，使樣品氨基酸總量在50～75mg范圍內，置于聚四氟乙烯襯管中，加4mol/L氫氧化鋰溶液（稱取一水合氫氧化鋰16.78 g ，用水溶解并稀釋至100 mL，使用前取適量超聲或通氮脫氣） 1.50 ml，于液氮中冷凍，而后將襯管插入水解玻管，抽真空至7Pa（≤5Х10-2,mm汞柱），封管。然后，將水解管放入（110士1）℃恒溫干燥箱，水解20小時。取出水解管，冷至室溫，開管，將水解液定量地轉移到50mL容量瓶中，加入6mol鹽酸溶液1.00 mL中和，并加水定容刻度。用0.45 μm濾膜過濾后，取清液貯于冰箱中，供衍生使用。

（注：若樣品顆粒較大，則在稱樣前應對樣品粉碎，過孔徑為0.25mm的樣品篩，并充分混勻。另外若在試樣提取過程中，過濾太慢，也可離心10 min （4000 r/min）。

1.5.3  氨基酸標準溶液和樣品溶液的衍生

準確量取樣品溶液200μl，置1.5ml塑料離心管中，準確加入20μl正亮氨酸內標溶液，混勻，用氮吹儀上吹干后，加220μl 0.1mol/L鹽酸溶解，加入三乙胺乙腈溶液100µl，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100µl，混勻，室溫放置1小時，然后加入正己烷400µl，振搖后放置10分鐘，取下層溶液，用0.45µm小濾器過濾。另準確量取混合氨基酸標準溶液200µl，置一1.5ml塑料離心管中，準確加入20μl正亮氨酸內標溶液，混勻，加入三乙胺乙腈溶液100µl，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100µl，混勻，室溫放置1小時，然后加入正己烷400µl，振搖后放置10分鐘，取下層溶液，用0.45µm小濾器過濾。
 

 

出峰順序：

1 Asp（門冬氨酸）     2 Glu（谷氨酸）    3 Ser（絲氨酸 ）      4 Gly（甘氨酸 ）    5 His（組氨酸）     

6 Arg （精氨酸）      7 Thr（蘇氨酸）    8 Ala（丙氨酸）       9 Pro（脯氨酸 ）    10 NH₃ （氨）   

11 Tyr（酪氨酸）      12 Val（纈氨酸）   13 Met（蛋氨酸）    14 Cy2（胱氨酸）   15 Ile（異亮氨酸）  16  Leu（亮氨酸）       17 Nle（正亮氨酸）（內標）      18  Phe（苯丙氨酸）  19  Trp（色氨酸）      20  Lys（賴氨酸）

專屬性實驗結果表明，包括氨及內標物在內的20種氨基酸得到*分離，相鄰氨基酸峰之間均達到基線分離，分離度均大1.5，本方法具有良好的專屬性。

2. 3.1進樣重復性

 

2.3.2衍生重復性 （同一份樣品重復衍生6份，分別進樣測定）

 

 

重復性試驗結果表明：重復性良好，18種氨基酸保留時間RSD＜0.2％，各氨基酸峰面積與內標峰面積的比值的RSD＜1％，18種氨基酸的衍生重復性RSD＜1％。 

測定了市售兔肉肥飼料和益多快長素飼料，分別酸水解和堿水解后測定其氨基酸含量，結果見圖3

   

 

樣品溶液中各種氨基酸濃度（μg/mL） =f₁/f₂×C

其中： f₁=樣品溶液中各氨基酸峰面積/內標峰面積

f₂=混合氨基酸標準溶液中各氨基酸峰面積/內標峰面積

C=氨基酸對照品濃度（μg/mL）

樣品中總氨基酸含量（％）= 樣品溶液中所有氨基酸濃度總和（μg/mL）×V×10^-6×100 /W
其中： V＝樣品溶液的定容體積（mL）
       W＝樣品質量（g）

Venusil AA分析方法使用PITC柱前衍生法測試氨基酸組成快速、靈敏；衍生方便、快速，衍生物單一、穩定，-20°C可貯存數月；結果準確，試劑、副產物、溶劑等多種干擾因素可通過快速蒸發去除；紫外檢測（254mm）靈敏度高；一、二級氨基酸均可檢測。本方法測定飼料中的氨基酸結果準確可靠，適用于各種品牌的液相色譜儀，值得廣泛推廣。